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微流控技术及其特点
发布时间:2019-12-02        浏览次数:447        返回列表
 数字核酸扩增和检测方法可提供出色的灵敏度和特异性,并可以对目标核酸进行绝对定量。在这些方法中,数字聚合酶链反应(PCR)通常用于DNA扩增和绝对定量,其也是众多数字化分析检测方法的起源。dPCR由于其反应时间长且需要精细的温度控制,因此对于POC应用并不理想。微流控提供了一种快速,低成本的选择,利用同样的数字化思路,微流控的出现和发展逐渐得到人们的关注。本推送主要介绍微流控的主要技术原理。

什么是微流控及其技术原理

 

从原理上讲,微流控使用两套或三套引物和一种具有复制活性以及高链置换活性的聚合酶,可在60–65°C的恒定温度下扩增靶序列通常,使用4种不同的引物来鉴定靶基因上的6个不同区域,从而大大提高了特异性。另外一对“环引物”可以进一步加速反应。由于这些引物作用的特殊性质,在微流控中产生的DNA量明显高于基于PCR的扩增。另一方面,引物的增加也使得微流控引物设计变得更加困难,常常需要依赖第三方软件和报道文献进行辅助设计。

 

微流控的扩增产物可以通过光度法进行检测,微流控反应溶液中作为扩增副产物的焦磷酸镁沉淀可以通过肉眼轻松观察,特别是对于较大的反应量,因此可用此开发肉眼读出的POC传感器。同时,微流控也可通过测量浊度或通过使用嵌入染料(例如SYTO 9)进行荧光实时跟踪反应。SYBR green等染料可以用于创建可见的颜色变化,而无需使用昂贵的设备即可用肉眼看到该颜色变化,或者可以通过仪器更准确地测量出响应。

 

LAMP的反应体系一般包括4条引物、Bst DNA聚合酶缓冲液、具有链置换特性的Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、甜菜碱、Mg2SO4等。LAMP检测体系中基因的扩增和产物的检测可一步完成,扩增效率高,可在30~60 min扩增109~1010倍,特异性较高;同时反应过程中,从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物焦磷酸镁。LAMP技术的主要原理是DNA在65 ℃左右可以处于动态平衡状态,DNA在此温度下利用4条特异性引物依靠一种链置换DNA聚合酶,使链置换DNA的合成不停地自我循环。

 

微流控核酸扩增的特点和平台

 

准确度高

 

通过样本的离散化,极微量的变异分子与正常分子被区分开来,使得稀有突变基因被单独检测,再通过阳性信号单元所占的数量和比例来精准地计算突变率或突变量。

 

灵敏度高

 

有对低拷贝核酸分子数的区分能力。

 

绝对定量

 

以阳性信号和阴性信号微单元的数量及比例来确定原始样本中目标核酸分子数,不需建立标准曲线即可进行精确定量。

 

不易受抑制剂的影响

 

通过分散到各个反应微单元,能够有效降低了抑制剂对扩增的影响。


总结

微流控核酸扩增技术是一种高灵敏度、高准确度、高辨识力、高耐受性、可实现绝对定量分析的核酸分子诊断技术,是现有核酸诊断技术的补充,其所具备的应用优势必将大大推动生物学研究、临床诊断、食品安全和环境监测等领域的发展。同时,它也预示着一个拥有巨大潜能的新兴产业和技术。微流控相对于dPCR速度更快,成本也更低,在dPCR难以实现POCT的情况下,不失为一个新的选择。目前的数字化核酸扩增技术仍处于待完善阶段,还存在许多不足之处。